研究人员将单细胞基因表达研究带到你身边的工作台

时间:2020-05-15 18:46 来源:seo 作者:杏鑫 点击量:

研究人员将单细胞基因表达研究带到你身边的工作台

通过破坏特定基因的表达,观察这种变化如何影响其他基因的表达,研究人员可以了解被破坏基因的细胞作用。微扰-seq等新技术为此类遗传干扰研究提供了前所未有的细节和深度洞察,但技术和实际障碍限制了微扰-seq的应用。普林斯顿大学研究员布里特·亚当森(Britt Adamson)及其加州大学旧金山分校(University of California-San Francisco)和生物技术公司10X Genomics的同事在3月30日的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上发表了一项新研究,旨在改变这一现状。

亚当森说:“我们对这种方法提出了几个改进,它们共同为在更大的范围内使用组合扰动执行扰动seq屏幕奠定了基础。”

扰动seq的第一步是扰动一组目标基因。这是通过使用一套基于crispr的技术来编辑细胞的基因组来完成的。

CRISPR技术是从细菌和古生菌中发现的防御系统改造而来的。这些生物包含从感染它们的病毒中捕获的DNA片段(称为有规律的集群间隔回文重复,或CRISPRs)。细菌和古生菌利用CRISPR序列产生RNA片段,引导CRISPR相关(Cas)酶进入病毒基因组(DNA,在某些情况下是RNA)。一旦到了那里,这些酶就会切断结合的基因组并停止感染。

科学家们已经将这些系统用于动物细胞,方法是使用一种名为“导向”(guides)或sgRNAs的人工合成rna,这种rna可以将Cas酶靶向到细胞自身的DNA上。在那里,卵裂引入可遗传的突变并破坏目标基因。或者,科学家可以使用一种失活的Cas,它可以结合到目标基因上,阻止(CRISPRi)或增强(CRISPRa)基因的表达。

微扰seq的第二步是研究目标基因的微扰如何影响细胞表达的其他基因的模式。这是通过一种叫做单细胞RNA测序(scRNA-seq)的技术完成的,它提供了单个细胞基因表达的读出。简而言之,scRNA-seq从细胞群中的单个细胞中收集并标记由基因表达的分子(称为信使rna或mRNAs)。

利用计算机,研究人员可以读取附在mRNA序列上的标签,并将每个细胞的mRNA标识进行分组。这使得研究人员可以评估每个细胞的基因表达谱,或“转录组”,以确定细胞之间的相似性或差异性。

重要的是,在微扰seq中,输入细胞群携带基于crispr的微扰,并且因为sgRNAs是将组装的转录组映射到这些微扰的关键,所以还必须为每个细胞确定sgRNA标识。然而,标准scRNA-seq方法不能捕获sgRNAs。因此,为了进行摄动-seq实验,研究人员之前一直依赖于间接映射的方法。这些方法受到技术限制。例如,当多个sgRNAs被传递到每个细胞时,它们很难使用。

这些就是亚当森和她的合作者们所面临的问题。加州大学旧金山分校(University of California-San Francisco)的实习生想要解决这个问题。“我们开发了在不同scRNA-seq平台上捕获sgRNA序列的协议,”Adamson说。

研究人员将这些新协议称为“直接捕获扰动-seq”,它提供了一种方法,可以在scRNA-seq期间捕获并放大sgRNAs与细胞转录组。重要的是,直接捕获微扰-seq允许研究人员以一种简单的方式跟踪单个细胞中多个sgRNAs的存在,该团队表明这也可以用于改进CRISPRi。

为了演示直接捕获扰动seq应用的其他方法,作者使用它来复制和扩展早期研究的结果。最初的研究考察了扰乱基因对细胞生长的影响,结果表明,阻止胆固醇生物合成中某些基因的表达,会导致一种损害细胞DNA的代谢中间体的形成。通过直接捕获微扰seq,研究人员能够快速描述细胞对这些基因的抑制做出的反应,开发出细胞如何管理中间产物影响的模型,并发现当它们不能控制时细胞会发生什么。

第二个改进是,该团队还从scRNA-seq转录组中富集了特定基因的mrna,使得上述的scRNA-seq实验的执行成本更低。亚当森说:“总的来说,这些改进应该有助于研究人员扩大微扰seq实验的规模,更好地研究基因如何工作。”

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